Post by jone447 on Aug 2, 2023 1:55:14 GMT -5
胞和注射 PBS 的小鼠。，用 Trizol 试剂 (Sigma) 分离 RNA。为了防止在 RNA 分离和分析过程中 4SU 可能被氧化，在洗涤缓冲液和后续酶促步骤中添加了 0.1 mM DTT。如前所述，RNA 被消化并去磷酸化为单核苷酸77。简而言之，将 40 μg 纯化的总 RNA 在 30 µL 中与 0.4 U 细菌碱性磷酸酶（Worthington Biochemical）和 0.09 U 蛇毒磷酸二酯酶（Worthington Biochemical）
在 37 °C 下孵育 16 小时。作为参考标准，使用合成亚洲手机号码列表的 4SU 标记的 RNA 寡核苷酸（序列：CGUACGCGGAAUACUUCGA(4SU)U）并进行相同的酶消化。含有单一核糖核苷的反应混合物通过HPLC在Supelco Discovery C18（键合相二氧化硅5μM颗粒，250×4.6mm）反相柱（Sigma）上分离。采用等度梯度进行
分离：0% B 15 分钟，0 至 10% B 20 分钟，10 至 100% B 30 分钟，流动相 (A) 3% 乙腈的 0.1 M TEAA 溶液（92:5:3 去离子水：2 M TEAA：乙腈）和流动相 (B) 90% 乙腈的水溶液。两次运行之间使用 100% 清洗 HPLC 柱 (B)。碱基组成是根据寡核苷酸的积分面积计算的。 体内 PAR-CLIP HPLC 纯化的 (≥ 98%) 4-硫尿苷 (4SU) 购自 Tocris（货号 7005），避光，使用